dgkh000133
10.3205/dgkh000133
urn:nbn:de:0183-dgkh0001335
Originalarbeit
Beeinflussung der Penetration von Pseudomonas aeruginosa in eine 3-D-Epidermis und Inaktivierung mit gewebeverträglichem Plasma
Influencing of the penetration of Pseudomonas aeruginosa into a 3-D epidermis model and the inactivation with tissue tolerable plasma
Matthes
Matthes
Rutger
R
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Walther-Rathenau-Str. 49a, 17489 Greifswald, DeutschlandInstitut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
rutger.matthes@uni-greifswald.de
author
Bender
Bender
Claudia
C
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Hübner
Hübner
Nils-Olaf
NO
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Müller
Müller
Gerald
G
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Kohl
Kohl
Katharina
K
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Mentz
Mentz
Jaqueline
J
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Koban
Koban
Ina
I
Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Greifswald, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Kindel
Kindel
Eckhard
E
Leibniz-Institut für Plasmaforschung und Technologie e.V., Greifswald, Deutschland
author
Kocher
Kocher
Thomas
T
Zentrum für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde Greifswald, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
Weltmann
Weltmann
Klaus-Dieter
KD
Leibniz-Institut für Plasmaforschung und Technologie e.V., Greifswald, Deutschland
author
Lademann
Lademann
Jürgen
J
Zentrum für Angewandte Hautphysiologie an der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité - Universitätsmedizin Berlin Campus Charité, Deutschland
author
Kramer
Kramer
Axel
A
Institut für Hygiene und Umweltmedizin, Ernst-Moritz-Arndt Universität, Greifswald, Deutschland
author
German Medical Science GMS Publishing House
Düsseldorf
610
low temperature plasma
HF-Plasma Jet
tissue tolerable plasma
Pseudomonas aeruginosa
infection of epidermis equivalents
antiseptic plasma effect
Niedertemperaturplasma
HF-Plasma Jet
tissue tolerable plasma
Pseudomonas aeruginosa
Infektion von Epidermisäquivalenten
antiseptischer Plasmaeffekt
20091216
germ
1863-5245
4
2
GMS Krankenhaushygiene Interdisziplinär
GMS Krankenhaushyg Interdiszip
Die infizierte Problemwunde 2009 - The infected problem wound 2009
08
Problemstellung: Die Biofilmbildung spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler akuter und subakuter mikrobieller Infektionen sowie bei chronischen Wunden. Zur Förderung der Wundheilung eignet sich gewebeverträgliches Plasma (tissue tolerable plasma – TTP) als Alternative zu antiseptischen oder chemotherapeutischen Therapien. Unbekannt ist dabei der mechanische Einfluss von Argon-Plasma auf das Eindringen der Bakterien in das Gewebe in Verbindung mit der anmikrobiellen Wirkung des Plasmas. Dazu wurden die Effekte von Argon-Plasma versus reinem Argongas auf die bakterielle Reduktion und die Eindringtiefe im Kombimodell von P. aeruginosa auf 3-D-Epidermismodellen untersucht.Methode: Es wurden 3-D-NHEK-Zellkulturen mit P. aeruginosa SG81 beimpft und nach 20 min Inkubation mit TTP behandelt. Die Verteilung und Eindringtiefe der Bakterien in der Zellkultur wurde mittels konfokalem Laserscanmikroskop (CLSM) zwischen Kontrolle (Argongas) und TTP-Einwirkung verglichen. Die Ermittlung der antimikrobiellen Wirkung von TPP erfolgte anhand der Bestimmung der Koloniebildenden Einheiten (KbE). Ergebnis: Es konnten die Penetration der Bakterien in das Epidermisgewebe und eine signifikante Erregerreduktion mittels TTP nachgewiesen werden. Damit ergeben sich begründete Chancen für eine Wundbehandlung mit TTP.
Aim: The biofilm formation plays a crucial role in the pathogenesis of many acute and subacute microbial infections as well as of chronic wounds. For the stimulation of wound healing tissue tolerable plasma (TTP) is an alternative to antiseptic or chemotherapeutic therapies. The mechanical influence of argon plasma on the penetration of bacteria into the tissue related to the antimicrobial effect of the plasma is unknown. Hence the effects of argon plasma versus argon gas were examined for bacterial reduction as well as for the penetration depth of P. aeruginosa in a 3-D human epidermis model, the so-called combi-model.Method: 3-D NHEK cell cultures were inoculated with P. aeruginosa SG81 and treated after 20 min incubation with TTP. The distribution and penetration depth of the bacteria in the cell culture were compared by confocal laser scan microscope (CLSM) between control and TTP effect. Result: The penetration of bacteria into the epidermis tissue and a significant reduction of the bacteria could be proven by means of TTP. Therefore justified chances result for treatment of wounds with TTP.
EinleitungDie Biofilmbildung spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler akuter und chronischer mikrobieller Infektionen einschließlich chronischer Wunden . Bakterielle Biofilme sind bis zu 1000-fach resistenter gegenüber Therapien mit Antibiotika und Antiseptika als planktonisch lebende Bakterien , , . Niedertemperaturplasma wirkt dosisabhängig mikrobiozid , , und ist im Bereich gewebeverträglicher Temperaturen auch auf der Körperoberfläche anwendbar , , . Im Unterschied zur chemischen Antiseptik kann dem Wundgewebe durch die Anwendung von Plasma zugleich Energie zugeführt werden, was zur Förderung des Heilungsprozesses beitragen dürfte. Deshalb wird die Möglichkeit der medizinischen Plasmaanwendung weltweit in hierfür spezialisierten Zentren untersucht. Gewebeverträgliches Plasma (tissue tolerable plasma – TTP) kann eine Alternative zur antiseptischen Behandlung biofilmassoziierter Wundinfektionen darstellen Beim Einsatz des HF-Plasmajets kINPen09 (INP, Greifswald) wird das generierte Plasma in einem Gasstrom getragen. Dabei erzeugt der Gasdruck einen mechanischen Effekt auf die zu behandelnde Oberfläche. Aus diesem Grund ist es von Interesse, den Effekt des alleinigen Gasdrucks mit dem des Plasmas auf die Verteilung der Bakterien in den oberen Gewebeschichten und die antimikrobielle Wirksamkeit zu untersuchen. Der Nebeneffekt des Gasdrucks von TTP wurde bisher nicht berücksichtigt, könnte aber einen Einfluss auf den Behandlungserfolg haben. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss der Plasmabehandlung sowohl auf die Verteilung als auch auf die Reduktion von Bakterien im 3-D-Epidermismodell zu untersuchen.
Material und MethodenFür die Versuche wurde P. aeruginosa SG81 eingesetzt. Dieser Stamm wurde vom Biofilm Center Duisburg-Essen, Deutschland, aus einem Biofilm in einem technischen Wassersystem isoliert und ist als Biofilmbildner gut charakterisiert , . Nach Anzucht auf Blutagar wurden Subkulturen wiederum auf Blutagar erstellt und für 24 h bei 37°C inkubiert. Nach anschließendem Abschwemmen und 3-maligem Waschen wurde bei 2500 U/min für <![CDATA[15 min</PlainText></TextGroup> zentrifugiert, der Überstand dekantiert und in je <TextGroup><PlainText>5 ml</PlainText></TextGroup> gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Dem zur Färbung im Epidermismodell vorgesehenen Bakterienpellet wurden nach dem letzten Zentrifugieren 500 µl einer Lösung von 100 µg Acridin Orange/mL (AppliChem-BioChemica, Darmstadt, Deutschland) zugegeben, resuspendiert und 20 min inkubiert. Die gefärbte Bakteriensuspension enthielt ca. 1x10<Superscript>9</Superscript> KbE/ml und wurde 2x mit PBS gewaschen, um den Fluoreszenzfarbstoff zu eliminieren und danach auf die Startkonzentration von 1x10<Superscript>7</Superscript> KbE/ml verdünnt. Für die Bestimmung der KbE (separater Ansatz) wurden ungefärbte Erreger verwendet. Die Startkonzentration lag ebenfalls bei 1x10<Superscript>7</Superscript> KbE/ml.</Pgraph><Pgraph>Die Anzucht von normalen humanen epidermalen Zellen (NHEK) erfolgte nach mehrfacher Passage auf kommerziellen Polycarbonat-Inserts (Millicell<Superscript>®</Superscript>, Millipore Corp., Billerica, Massachusetts, USA) unter Verwendung serum- und antibiotikafreier Medien unter aseptischen Kautelen <TextLink reference="13"></TextLink>. Durch Stratifizierung und Keratinisierung bildeten sich dreidimensionale Strukturen aus, die im Aufbau der menschlichen Epidermis entsprechen. Die Qualitäts- und Vitalitätsprüfung dieser Epidermismodelle (EM) erfolgte mittels MTT-Test <TextLink reference="14"></TextLink> und durch Messung des Transepidermalen Elektrischen Widerstands (TER) unter Verwendung eines Volt-Ohmmeters mit Spezialelektrode (EVOMX und STX2-Elektrode, World Precision Instruments, Berlin). Die Epidermismodelle kamen am Tag 18 nach Airlift zum Einsatz.</Pgraph><Pgraph>25 µl der Fertigsuspension der gefärbten Bakterien wurden auf je ein Epidermismodell gegeben und anschließend bei 37°C für 20 min inkubiert. Je 8 Epidermismodelle wurden mit Argon-Plasma bzw. mit Argon behandelt. Als Kontrolle wurden 6 Epidermismodelle entsprechend der Gesamtbehandlungszeit, der Plasma- und Argonbehandlung, mitgeführt. Jeweils 6 der Epidermismodelle der Teilversuche wurden mikrobiologisch über die KbE und je 2 wurden mikroskopisch ausgewertet. </Pgraph><Pgraph>Als Plasmaquelle wurde ein HF-Plasmajet (Frequenz 1.82 MHz, Eingangsleistung 3 W) (kINPen 09, INP Greifswald), unter Verwendung von Argon als Trägergas <TextLink reference="15"></TextLink>, <TextLink reference="16"></TextLink> verwendet. Das im Jet generierte Plasma (räumliches after-glow Plasma, effluent) wird während der Behandlung bei einer Argon-Gasflussrate von 5 slm (Standardliter/min) auf die zu behandelnde Oberfläche gerichtet, wobei die Temperatur an der Plasmaspitze 42°C betrug (nach Temperatur-Kalibrierkurve, INP Greifswald). Bei dieser Temperatur wird auf der Oberfläche eine mittlere Wärmeleistung von etwa 150 mW generiert.</Pgraph><Pgraph>Zur Plasmaanwendung wurde der Plasmajet in einen computergesteuerten xyz-Tisch eingespannt und die zu behandelnden Epidermismodelle (EM) in der Mikrotiterplatte unter dem Jet positioniert (Abbildung 1 <ImgLink imgNo="1" imgType="figure" />). Der Abstand zu den Proben betrug 7 mm. Die gesamte Fläche der Epidermismodelle wurde mäanderförmig mit der Fahrgeschwindigkeit von 10 mm/s behandelt. Die Gesamtbehandlungsdauer je Probe betrug jeweils 1 min. </Pgraph><Pgraph>Die Bestimmung der KbE erfolgte nach Präparation der Polycarbonatmembran mitsamt dem darauf befindlichen Gewebe aus dem Insert-Ring. Die Membran wurde mit dem anhaftenden Gewebe in ein Reagenzröhrchen mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung überführt und anschließend mechanisch mit einem Glasstab 5 min homogenisiert. Die gewonnene Suspension wurde 10 min bei 130 W mit Ultraschall behandelt, 15 min bei 2500 U/min zentrifugiert und nach der spread-plate-Methode <TextLink reference="17"></TextLink> bestimmt. </Pgraph><Pgraph>Die mikroskopische Auswertung erfolgte mit einem Zeiss CLSM510 Exciter, Carl Zeiss Jena, Deutschland.</Pgraph></TextBlock>
<TextBlock name="Ergebnisse" linked="yes">
<MainHeadline>Ergebnisse</MainHeadline><Pgraph>Die Reduktion der Erreger betrug im Mittel 1,7 log<Subscript>10</Subscript> (KI ±0,16, 95%-Kl) im Vergleich zur Kontrolle. Im Vergleich zum Argon betrug die Reduktion 1,2 log<Subscript>10</Subscript> (p<0,01, signifikant nach Wilcoxon-Mann-Whitney-Test) und beschreibt somit die reine Plasmawirkung (Abbildung 2 <ImgLink imgNo="2" imgType="figure" />). Die Reduktion des Argon-Gasstroms im Vergleich zur Kontrolle ist dagegen nicht signifikant.</Pgraph><Pgraph>Anhand der CLSM-Untersuchung konnte ein Eindringen der Bakterien in das Gewebe nach TTP-Behandlung, Begasung mit reinem Argon und ebenso bei der unbehandelten Kontrolle beobachtet werden. Nach der TTP-Anwendung zeigte sich eine Eindringtiefe der Bakterien von ca. 16 µm (Abbildung 3 <ImgLink imgNo="3" imgType="figure" />) und nach Argon von ca. 32 µm (Abbildung 4 <ImgLink imgNo="4" imgType="figure" />) im Vergleich zur Kontrolle mit ca. 14 µm Eindringtiefe (Abbildung 5 <ImgLink imgNo="5" imgType="figure" />).</Pgraph><Pgraph>In Abbildung 6 <ImgLink imgNo="6" imgType="figure" /> ist zur Veranschaulichung ein dreidimensionales Bild der Kontrolle des Epidermisäquivalents wiedergegeben.</Pgraph></TextBlock>
<TextBlock name="Diskussion" linked="yes">
<MainHeadline>Diskussion</MainHeadline><Pgraph>Biofilme erschweren die Behandlung mikrobieller Infektionen. Das gilt insbesondere, wenn abiotische Fremdkörper in der Wunde vorhanden sind und eine dem Immunsystem schwer zugängliche Grundlage zur Biofilmentstehung bilden <TextLink reference="1"></TextLink>. Die Therapie mikrobieller Biofilme mit antiseptischen Maßnahmen stößt bei der Behandlung von Biofilmen aufgrund der erhöhten Resistenz der Erreger an ihre Grenzen. Vor diesem Hintergrund kommt der physikalischen Behandlung von Biofilmen eine besondere Bedeutung zu. TTP ist eine potentielle physikalische Alternative zur chemischen Antiseptik, da im Epidermismodell durch TTP-Applikation eine Reduktionsrate von 1,7 (log<Subscript>10</Subscript>) und auf Polystyrol und Silicon bei gleichen Plasma-Einstellungen eine Reduktion des <Mark2>P. aeruginosa</Mark2> SG 81 von 3 log<Subscript>10</Subscript> erreicht wurde <TextLink reference="7"></TextLink>. In den letzten Jahren sind an mehreren Zentren Plasmaquellen zur Wundbehandlung entwickelt und getestet worden <TextLink reference="18"></TextLink>, <TextLink reference="19"></TextLink>, <TextLink reference="20"></TextLink>, <TextLink reference="21"></TextLink>. Der Vorteil physikalischer Verfahren liegt in ihrer Standardisierbarkeit und dem Fehlen des Eintrags des Antiseptikums mit möglichen zytotoxischen Effekten in der Wunde. </Pgraph><Pgraph>In unseren Versuchen zeigte sich, dass die durch TTP erreichte Reduktion mit 1,2 log<Subscript>10</Subscript> statistisch signifikant war und bestätigt, dass eine antibakterielle Wirkung in der humanen Epidermis mittels TTP erreichbar ist. </Pgraph><Pgraph>In der vorliegenden Untersuchung wurde das Eindringen von <Mark2>P. aeruginosa</Mark2> SG 81 in Epidermismodelle untersucht. In der Kontrolle fand eine Penetration der Bakterien in das Gewebe statt, was auf ihre Eigenbewegung schließen lässt. Es zeigte sich, dass bei den mit Gas behandelten Epidermismodellen die Bakterien tiefer in das Gewebe eingedrungen sind, während dieser Effekt unter Plasmaeinwirkung weniger ausgeprägt war. Da Plasma zu einer Inaktivierung und damit zu einer reduzierten Motilität der Bakterien führt, kann das der Grund dafür sein, dass die Bakterien im Vergleich zu reinem Argon-Gas weniger stark in das Gewebe penetrieren. Damit liefern die Ergebnisse einen ersten Anhaltspunkt, dass der Gasdruck von Einfluss auf die Verteilung der Erreger und für deren Inaktivierung sein kann. Zur Absicherung sind weitere Untersuchungen geplant. Zugleich sind diese Ergebnisse richtungweisend für die Entwicklung neuer Plasmaquellen. </Pgraph></TextBlock>
<TextBlock name="Danksagung" linked="yes">
<MainHeadline>Danksagung</MainHeadline><Pgraph>Die Arbeit wurde innerhalb des 2008 vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) bewilligten interdisziplinären Projekts „CampusPlasmaMed“ innerhalb des Leitprojekts „PlasmaBiozid“ erstellt. Die Autoren danken dem BMBF für die Förderung (BMBF, Förderkennzeichen 13N9779).</Pgraph></TextBlock>
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<Caption><Pgraph><Mark1>Abbildung 1: Vorrichtung zur Plasmabehandlung der Zell-Inserts</Mark1></Pgraph></Caption>
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<Caption><Pgraph><Mark1>Abbildung 3: Verteilung von </Mark1><Mark1><Mark2>P. aeruginosa</Mark2></Mark1><Mark1> SG 81in den Keratinozytenschichten im Epidermismodell in unterschiedlichen Schichttiefen nach TTP-Behandlung für 1 min (Fluoreszenzfarbstoff Acridin Orange) </Mark1></Pgraph></Caption>
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<Caption><Pgraph><Mark1>Abbildung 4: Verteilung von </Mark1><Mark1><Mark2>P. aeruginosa</Mark2></Mark1><Mark1> SG 81 in den Keratinozytenschichten im Epidermismodell in unterschiedlichen Schichttiefen nach Argon-Behandlung für 1 min (Fluoreszenzfarbstoff Acridin Orange) </Mark1></Pgraph></Caption>
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<Caption><Pgraph><Mark1>Abbildung 5: Verteilung von </Mark1><Mark1><Mark2>P. aeruginosa</Mark2></Mark1><Mark1> SG 81 in den Keratinozytenschichten im Epidermismodell in unterschiedlichen Schichttiefen in der Kontrolle (Fluoreszenzfarbstoff Acridin Orange) </Mark1></Pgraph></Caption>
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<Caption><Pgraph><Mark1>Abbildung 6: Darstellung der Kontrolle in 3-D, Fluoreszenzfarbstoff Acridin Orange, </Mark1></Pgraph><Pgraph><Mark1>Überblick über die Verteilung von </Mark1><Mark1><Mark2>P. aeruginosa</Mark2></Mark1><Mark1> SG81 auf und zwischen den Keratinozyten</Mark1></Pgraph></Caption>
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<Caption><Pgraph><Mark1>Abbildung 2: Wirksamkeit von TTP im Vergleich zur Behandlung mit Argon und Kontrolle</Mark1></Pgraph></Caption>
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