dgkh000131 10.3205/dgkh000131 urn:nbn:de:0183-dgkh0001319 Originalarbeit Characterization of wound healing by in vivo laser scanning microscopy Lademann Lademann Jürgen J Prof. Dr. Dr.-Ing.

Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Bereich Hautphysiologie, Charitéplatz 1, 10117 Berlin, Deutschland, Tel.: 030/450518100, Fax 030/450518918Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Deutschland

juergen.lademann@charite.de author Kramer Kramer Axel A Prof. Dr. med.

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

kramer@uni-greifswald.de author Meyer Meyer Lars L

Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Deutschland

author Alborova Alborova Alena A

Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Deutschland

author Sterry Sterry Wolfram W

Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Deutschland

author Lange-Asschenfeldt Lange-Asschenfeldt Bernhard B

Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Charité – Universitätsmedizin Berlin, Deutschland

author German Medical Science GMS Publishing House

Düsseldorf

610 in vivo laser scanning microscopy suction blister technique wound healing quantitative analysis In-vivo-Laser-Scan-Mikroskopie Saugblasentechnik Wundheilung quantitative Analyse 20091216 germ 1863-5245 4 2 GMS Krankenhaushygiene Interdisziplinär GMS Krankenhaushyg Interdiszip Die infizierte Problemwunde 2009 - The infected problem wound 2009 06 Die erfolgreiche Entwicklung der optischen Technologien in den letzten Jahren führte zu Analysesystemen, die speziell im Bereich der Dermatologie neue Möglichkeiten der Anwendung erschließen. Im vorliegenden Beitrag wird über den Einsatz eines In-vivo-Laser-Scan-Mikroskops zur Charakterisierung von Wundheilungsprozessen berichtet. Im Gegensatz zum Goldstandard – den Messungen des transepidermalen Wasserverlusts (TEWL) – hat diese optische Methode den Vorteil, dass sie nicht durch Störfaktoren wie Wundflüssigkeit und topisch applizierte Substanzen beeinflusst wird. In der vorliegenden Studie wurden definierte oberflächliche Wunden mit Hilfe der Saugblasentechnik erzeugt und deren Abheilungsprozess mit Hilfe der In-vivo-Laser-Scan-Mikroskopie (LSM) untersucht. Es zeigte sich, dass die LSM-Technik eine objektive Bewertung des Wundheilungsprozesses ermöglicht. Durch die Einführung von charakteristischen Stadien der Wundheilung ist es sogar möglich, eine quantitative Bewertung des Wundheilungsprozesses vorzunehmen. Im Rahmen der Untersuchungen konnte u.a. nachgewiesen werden, dass der Wundheilungsprozess nicht nur von den Wundrändern her erfolgt. Auch um die Haarfollikel bilden sich Inseln von Korneozyten, die allmählich miteinander verschmelzen und zu einer ersten Bedeckung der Wundoberfläche mit einer geschlossenen Zellschicht von Korneozyten führen. Recent developments of new optical technologies in the past years lead to modern analytical systems suitable for new applications in the field of dermatology. In our study we describe the value of in vivo laser scanning microscopy (LSM) for the characterization of wound healing. In contrast to the gold standard – the measurements of the transepidermal water lost (TEWL) – this optical method has the advantage not to be disturbed by any interstitial fluid or topically applied substances. Standardized superficial wounds were produced by the suction blister technique and the healing process of the wounds was investigated using LSM. The LSM method has been proven to be a suitable technique for an objective evaluation of the wound healing process. Quantitative analysis of the healing process was facilitated by introducing scales characterizing the exact healing phase of the investigated wounds. This study revealed that the onset of tissue repair is not rectricted to the edges of the cutaneous wound but is found at the same time around the area of the hair follicles. Small islands of corneocytes were forming around the hair follicles leading to fully covered wound surface consisting of a first layer of corneocytes. EinleitungMit der Zunahme der Lebenserwartung der Bevölkerung in den meisten Industrieländern kommt der Problematik der Wundheilung, speziell bei älteren Patienten, eine zunehmende Bedeutung zu.Gegenwärtig sind verschiedene Wundcremes und Wundauflagen kommerziell verfügbar , , . Viele neue Produkte befinden sich in der Entwicklung. Die objektive Bewertung der Effektivität dieser Produkte bzw. entsprechender Therapieverfahren stellt bis heute ein Problem dar , . Der gegenwärtige Goldstandard, der zur Bewertung der Barriereeigenschaften der Haut eingesetzt wird – die Bestimmung des transepidermalen Wasserverlustes (TEWL) – ist nur bedingt zur Charakterisierung der Wundheilung geeignet , , . Zum einen sind Wunden häufig mit einem Film aus Wundflüssigkeit bedeckt. Zum anderen enthalten die meisten der Wundsalben wässrige Bestandteile, die auf der Haut abdampfen . Beide Prozesse führen dazu, dass die TEWL-Messungen gestört werden.Im vorliegenden Beitrag wird der Einsatz der In-vivo-Laser-Scan-Mikroskopie (LSM) , , zur Charakterisierung der Wundheilung auf zellulärer Ebene vorgestellt. Die Untersuchungen wurden dadurch möglich, dass es heute miniaturisierte Laser- und Detektionssysteme gibt, die es in Verbindung mit Lichtleitfasern erlauben, mikroskopische Untersuchungen an jeder beliebigen Körperstelle von Patienten und Probanden durchzuführen . Mit Hilfe dieser Mikroskopiesysteme ist es möglich, die Reepithelialisierung der Wunden ungestört von der Behandlungsmethode zu analysieren. Der vorliegende Beitrag bezieht sich auf die Darstellung des Einsatzes der LSM zur Charakterisierung von Wundsalben. Darüber hinaus bietet die LSM wesentlich mehr Möglichkeiten im klinischen Alltag zur Diagnose und Therapiekontrolle , , , . Materialien und MethodenProbandenStandardisierte Wunden wurden mit Hilfe der Saugblasentechnik am Unterarm von gesunden männlichen und weiblichen Probanden erzeugt . Das Alter der Probanden lag zwischen 23 und 47 Jahren. SaugblasentechnikEine Vakuumkammer mit einem Durchmesser von 6 mm wurde auf die Hautoberfläche aufgesetzt und über einen Zeitraum von 120 min ein Unterdruck von 200 mm/Hg erzeugt. Innerhalb von 30 bis 60 min entsteht hierbei auf der Hautoberfläche eine Saugblase . Das Blasendach wurde anschließend entfernt. Damit entstand eine oberflächliche Wunde (Abbildung 1 ), die innerhalb von wenigen Tagen narbenfrei abheilt. In-vivo-Laser-Scan-MikroskopieDie Untersuchungen im Rahmen dieser Studie wurden mit Hilfe des In-vivo-Laser-Scan-Mikroskops „Stratum“ der Firma Optilass Ltd. (Melbourne, Australien) durchgeführt , . Das Gerät besteht aus einer Basisstation, die den Argonlaser (Lambda = 488 nm) und das Detektionssystem enthält , , . Die Laserstrahlung wird über Lichtleitfasern einem frei beweglichen Handstück zugeführt (Abbildung 2 ), das das optische Abbildungssystem und die Fokussteuerung enthält. Das Laser-Scan-Mikroskop wurde bei den hier beschriebenen Untersuchungen im Fluoreszenzmodus betrieben. Hierzu wurde eine 0,1%ige Lösung des Fluoreszenzfarbstoffes Fluoreszein auf die Wundoberfläche gegeben, um die Oberflächenstruktur des Gewebes sichtbar zu machen. Das Fluoreszenzsignal wurde wiederum durch ein Bündel von Lichtleitfasern dem Detektionssystem in der Basisstation zugeführt. Die Messfläche betrug 250 µm x 250 µm. Mit Hilfe des Laser-Scan-Mikroskops konnten Untersuchungen bis zu einer Tiefe von 150 µm im Gewebe durchgeführt werden. Ergebnis und DiskussionWird der Laserfokus von der Oberfläche einer gesunden Haut in das Gewebe verfahren, werden verschiedene Hautschichten sichtbar. In Abbildung 3A ist die oberste Hautschicht des Stratum corneum (SC) dargestellt. Die regelmäßige Anordnung der Korneozyten ist klar zu erkennen. Der Farbstoff hat sich besonders in den Lipidschichten zwischen den Korneozyten angelagert, so dass scharfe Strukturen erkennbar sind. Fährt man den Laserfokus tiefer in das Gewebe, wird die Grenze zwischen dem Stratum corneum (SC) und dem Stratum granulosum (SG) sichtbar. In Abbildung 3B ist links unten noch das Stratum corneum zu erkennen, während oben rechts bereits das Stratum granulosum erscheint. Die Korneozyten mit einem Durchmesser von ca. 5 µm lassen sich gut von den wesentlich kleineren Zellen im Stratum granulosum unterscheiden. Die Strecke, die der Laserfokus von der Hautoberfläche bis zur Grenze des Stratum corneum zur lebenden Epidermis verfahren wurde, entspricht der Schichtdicke des Stratum corneum und ist zur Charakterisierung der Hautbarriere sehr gut geeignet. Verlagert man die Fokusebene weiter in tiefere Gewebeschichten, wird die Papillarstruktur (PS) der Haut sichtbar. Innerhalb der Papillarstruktur sind einzelne Blutgefäße zu erkennen (Abbildung 3C ). Führt man derartige Untersuchungen an Wundoberflächen durch, die vorher mit Hilfe der Saugblasentechnik erzeugt wurden, sieht man anstelle der Hautbarriere einen Flüssigkeitsfilm, der sich durch interstitielle Flüssigkeit gebildet hat. Unterhalb dieses Films sind klar die intakten Strukturen des lebenden Gewebes zu erkennen. Der Flüssigkeitsfilm trocknet relativ schnell ein und bildet eine krustenförmige Struktur auf der Wundfläche. Nach ungefähr 5 d bildet sich die erste Schicht der Korneozyten heraus (Abbildung 4 ). Die Neubildung des Stratum corneum beginnt erwartungsgemäß an den Wundrändern. Aber auch um die Haarfollikel bilden sich kleine Inseln aus Korneozyten heraus. Innerhalb von 1–2 d verschmelzen diese Inseln miteinander, so dass sich eine komplette Bedeckung der Wundoberfläche mit ein bis zwei Zelllagen von Korneozyten ergibt. Beobachtet man den natürlichen Heilungsprozess, so hat sich nach ca. 8–10 d die Hautbarriere wieder vollständig herausgebildet. Jedoch weist diese Barriere noch keine glatte, homogene Oberflächenstruktur auf, wie das in Abbildung 3A gezeigt ist. Die Korneozyten zeigen eine unregelmäßige Anordnung. Erst nach 10–14 d wird eine Oberflächenstruktur erreicht, wie sie der Haut vor dem Setzen der Wunde entspricht. Die Laser-Scan-mikroskopischen Untersuchungen können sehr gut dafür eingesetzt werden, die Effektivität von Wundsalben bzw. Wundauflagen zu charakterisieren. Der Nachteil der In-vivo-Laser-Scan-Mikroskopie im Vergleich zu den TEWL-Messungen besteht darin, dass die Laser-Scan-Mikroskopie keine Zahlenwerte liefert, die einen quantitativen Vergleich und eine Bewertung des Wundheilungsprozesses ermöglichen. Daher wurde im Rahmen der verschiedenen Wundheilungsstudien vorgeschlagen, den einzelnen Stadien der Wundheilung, welche durch die LSM gut erfasst werden können, Zahlenwerte zuzuordnen. So ist z.B. das Stadium 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Wunde mit Wundsekret bedeckt ist, das eine geschlossene Kruste bildet. Im Stadium 2 hat sich die erste Lage des Stratum corneum neu herausgebildet. Die vollständige Neubildung des Stratum corneum ist durch das Stadium 3 charakterisiert. Diese Klassifikation ist sehr gut geeignet, die Wirkung von Wundsalben bzw. Wundauflagen mit Hilfe der Laser-Scan-Mikroskopie quantitativ zu bewerten. Damit steht eine nicht invasive online-Analysemethode zur Verfügung, die es ermöglicht, Wundheilungsprozesse unabhängig von äußeren Störfaktoren objektiv zu bewerten. Im Gegensatz zu den TEWL-Messungen erhält man bei der LSM-Analyse eine konkrete Vorstellung über den Zustand der Wunde, der durch einen entsprechenden Zahlenwert charakterisiert ist. Durch die ortsaufgelöste Messung mit Hilfe der In-vivo-Laser-Scan-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass der Wundheilungsprozess nicht nur von den Wundrändern her beginnt, sondern auch um die Haarfollikel herum. DanksagungWir danken der Stiftung für Hautphysiologie beim Stifterverband der Deutschen Wissenschaft für die finanzielle Unterstützung. Ryan TJ Infection following soft tissue injury: its role in wound healing 2007 Curr Opin Infect Dis 124-8 Ryan TJ. Infection following soft tissue injury: its role in wound healing. Curr Opin Infect Dis. 2007;20(2):124-8. DOI: 10.1097/QCO.0b013e32801a3e7c http://dx.doi.org/10.1097/QCO.0b013e32801a3e7c White RJ Cooper R Kingsley A Wound colonization and infection: the role of topical antimicrobials 2001 Br J Nurs 563-78 White RJ, Cooper R, Kingsley A. Wound colonization and infection: the role of topical antimicrobials. Br J Nurs. 2001;10(9):563-78. 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DOI: 10.1134/S1054660X06050033 http://dx.doi.org/10.1134/S1054660X06050033 0

1 1 Abbildung 1: Oberflächliche mit Hilfe der Saugblasentechnik erzeugte Wunde

2 2 Abbildung 2: Handstück des Laser-Scan-Mikroskops, das das optische Abbildungssystem und die Fokussteuerung enthält

3 3 Abbildung 3: Laser-Scan-mikroskopische Darstellung verschiedener Hautschichten. A) Stratum corneum (SC); B) Grenzschicht zwischen dem Stratum corneum (SC) und dem Stratum granulosum (SG); C) Papillarstruktur (PS) mit Blutgefäßen.

4 4 Abbildung 4: Nach ca. 5 d bildet sich die erste Zelllage von Korneozyten unter der verkrusteten Wundoberfläche heraus.

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