Revitalisierung von Säugerzellen nach Einwirkung von Antiseptika

dgkh000068 Originalarbeit Revitalisierung von Säugerzellen nach Einwirkung von Antiseptika Revitalisation of mammalian cells exposed to antiseptics Müller Müller Gerald G

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

author Kramer Kramer Axel A Prof. Dr. med.

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Walther-Rathenau-Str. 49 a, 17489 Greifswald, Deutschland, Tel.: +49-(0)3834-515542, Telefax: +49-(0)3834-515541Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

kramer@uni-greifswald.de author German Medical Science

Düsseldorf, Köln

610 revitalization of cells octenidine dihydrochloride polihexanide chlorhexidine digluconate silver-based antiseptics Zellrevitalisierung Octenidindihydrochlorid Polihexanid Chlorhexidindigluconat Silber-basierte Antiseptika 20071228 germ 1863-5245 2 2 GMS Krankenhaushygiene Interdisziplinär GMS Krankenhaushyg Interdiszip Die infizierte Problemwunde 2007 - The infected problem wound 2007 35 Die antiseptischen Wirkstoffe Octenidindihydrochlorid (OCT), Polihexanid (PHMB) und Polyvinylpyrrolidon-Iod (PVP-I) wurden gegenüber Epithelzellen (CHO-K1, ATCC CCL61) und Fibroblasten (L929, ATCC CCL1) hinsichtlich ihrer unmittelbaren (nach 30 min Kontakt) und nachfolgenden (auf die 30 min Kontakt folgende 24 h Folgekultur ohne Wirkstoff) zytotoxischen Reaktion im Vergleich zu Chlorhexidindigluconat (CHX) und silberhaltigen Präparaten untersucht. Als Nachweisverfahren wurden der MTT-Test (intrazelluläre Zytotoxizität) und der Neutralrot (NR)-Test (Zellmembranschädigung) verwendet. Konzentrationen von PVP-I, die bei den Prüfzellen nach 30 min Exposition einen Vitalitätserhalt >20% gewährleisten, revitalisieren während der 24 h Folgekultur ohne Wirkstoff vollständig. Die zytotoxische Wirkung von PHMB ist nur für die Zellmembran-Zytotoxizität bei Konzentrationen unterhalb der IC50 teilweise reversibel. Eine vollständige Revitalisierung ist jedoch nicht möglich, da gleichzeitig die intrazelluläre zytotoxische Wirkung von PHMB zunimmt. Die zytotoxische Wirkung von OCT, CHX und silberhaltigen Präparaten ist irreversibel. Der von den Zellen gebundene Wirkstoff bleibt gebunden und verstärkt während der 24 h Folgekultur seine zytotoxische Wirkung. Zellgebundenes OCT besitzt jedoch gegenüber zellgebundenem CHX den Vorteil, dass es gegenüber Mikrorganismen biologisch aktiv bleibt. The cytotoxic activity of the antiseptics octenidine dihydrochloride (OCT), polihexanid (PHMB), and povidone iodine (PVP-I) were investigated on epithelial cells (CHO-K1, ATCC CCL61) and fibroblasts (L929, ATCC CCL1) both immediately after 30 min exposure and after 30 min exposure followed by a culture after 24 h without active agents and compared with chlorhexidine digluconate (CHX), and silver-containing formulations. The cytotoxic reaction was detected using MTT assay (intracellular cytotoxicity) and neutral red (NR) assay (damage of the cell membrane). Concentrations of PVP-I resulting after 30 min in >20% vitality revitalize after 24 h of culture without PVP-I. The cytotoxic effect of PHMB is only partially reversible in the cell membrane cytotoxicity at concentrations below the IC50 (vitality >50%). A total revitalization was impossible, because simutaneously the intracellular cytotoxicity increases during the 24 h culture. The cytotoxic effect of OCT, CHX, and silver-containing formulations is irreversible, but only the cell-bound OCT remains biologically activity against microorganisms. Einleitung Der Wunsch beim Einsatz von antiseptischen Wirkstoffen besteht darin, dass das verwendete Antiseptikum eine bevorzugte Wirkung gegenüber Mikroorganismen besitzt und die Wundheilung nicht beeinträchtigt. Realität ist jedoch, dass bei der Mehrzahl der antiseptischen Wirkstoffe als unerwünschte Begleiterscheinung eine schädigende Wirkung in tierischen und menschlichen Geweben, insbesondere gegenüber den Zellen, auftritt. Deshalb ist es notwendig zu klären, wenn schon eine Zellschädigung nicht auszuschließen ist, wie sich die Zellen nach einer Schädigung verhalten, d.h. ob die verursachte Zellschädigung ggf. reversibel oder aber irreversibel ist. Methoden Für die durchgeführten Untersuchungen wurden Mäusefibroblasten der Linie L929 (ATCC CCL1) und Epithelzellen von Meerschweinchen der Linie CHO-K1 (ATCC CCL61) als Prüfzellen verwendet. Als antiseptische Wirkstoffe wurden Octenidindihydrochlorid (OCT) in Form von Octenisept® (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt), PVP-I in Form von Repithel®, Betaisodona®-Salbe und -Lösung (Mundipharma GmbH, Limburg) sowie Polihexanid (PHMB) in Form von Lavasept® (Fresenius Kabi GmbH, Oberursel) sowie zum Vergleich die zunehmend an Bedeutung zur antiseptischen Wundbehandlung verlierenden Wirkstoffe Chlorhexidindigluconat und Silber-haltige Antiseptika ausgewählt. Adhärente Zellkulturen mit >80% Konfluenz wurden mit 8 geeigneten Konzentrationen des jeweiligen Wirkstoffs in Zellkulturmedium mit 10% fetalem bovinen Serum (FBS) für 30 min bei 37°C exponiert. Als Nachweisverfahren der resultierenden Zytotoxizität wurden der MTT- und der Neutralrot (NR)-Test verwendet. Der MTT-Test basiert darauf, dass die mitochondriale Succinatdehydrogenase, ein Enzym der Atmungskette, das Tetrazoliumsalz MTT zu einem unlöslichen Formazan-Derivat metabolisiert, dass in vitalen Zellen gespeichert wird. Nach Elution des Formazans mittels salzsaurem Propan-2-ol wird der Farbstoffgehalt der exponierten Zellen spektralphotometrisch mit der Medium-Kontrolle verglichen. Beim NR-Test wird der Vitalfarbstoff NR ausschließlich von lebenden Zellen über die Zellmembran durch Endozytose (Pinozytose) aufgenommen und in den Lysosomen gespeichert. Nach Elution mit essigsaurem Ethanol werden die Farbstoffgehalte spektralphotometrisch bestimmt und mit der Kontrolle verglichen. Ergebnisse Es wurden IC50-Werte, d.h. Konzentrationswerte, bei denen 50% der Prüfzellen vital bleiben, aus Konzentrations-Zellvitalitäts-Beziehungen für den jeweiligen antiseptischen Wirkstoff abgeleitet, sowohl nach 30 min Kontakt mit den Prüfzellen als auch nach 30 min Kontakt und anschließender Folgekultur über 24 h. Für CHO-Zellen resultieren IC50-Werte von 3,35 mg PVP-I</PlainText></TextGroup>/ml in Repithel<Superscript>®</Superscript> sowohl im MTT- als auch im NR-Test nach 30 min Kontaktzeit und von 4,9 mg PVP-I/ml während der 24 h Folgekultur. Bei den L929-Zellen ist dieser Revitalisierungs-Effekt ebenfalls nachweisbar. Hier resultieren IC<Subscript>50</Subscript>-Werte von 4,6 mg PVP-I/ml (MTT- und NR-Test) nach 30 min Kontaktzeit und von 6,9 mg PVP-I/ml nach 30 min Kontakt und 24 h Folgekultur. Ähnliche Ergebnisse resultieren bei PVP-I in Salbe. Die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte betragen unmittelbar nach 30 min Kontakt mit den CHO-Zellen 4,9 mg PVP-I/ml und 8 mg PVP-I/ml nach 30 min Kontakt und 24 h Folgekultur. Der Revitalisierungseffekt ist bei Anwendung der L929-Zellen ebenfalls nachweisbar. Es resultieren IC<Subscript>50</Subscript>-Werte von 6,2 mg PVP-I/ml (MTT- und NR-Test) nach 30 min Kontakt und von 9,5 mg PVP-I/ml nach 30 min Kontakt und 24 h Folgekultur. Für PVP-I in der Lösung ist der Revitalisierungs-Effekt nur gegenüber den L929-Zellen nachweisbar. Die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte betragen nach 30 min Kontakt 3,9 mg PVP-I/ml (NR-Test) bzw. 4,2 mg PVP-I/ml (MTT-Test) und 5 mg PVP-I/ml (MTT- und NR-Test) nach 30 min Kontakt und 24 h Folgekultur. Gegenüber den CHO-Zellen blieben die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte dagegen weitestgehend konstant mit 2,5-2,7 mg PVP-I/ml sowohl nach 30 min Kontakt als auch nach 30 min Kontakt und 24 h Folgekultur.</Pgraph> <Pgraph>Für PHMB ist ein Revitalisierungseffekt nur im NR-Test und bei Konzentrationen unterhalb der IC<Subscript>50</Subscript> nachweisbar. Konzentrationen oberhalb der IC<Subscript>50</Subscript> bewirken im NR- und MTT-Test eine irreversible Schädigung. Die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte betragen nach 30 min Kontakt mit den CHO-Zellen 38 µg/ml (NR-Test) bzw. 112 µg/ml (MTT-Test) und nach 24 h Folgekultur 55 µg/ml (NR-Test) bzw. 72 µg/ml (MTT-Test). Gegenüber den L929-Zellen reagiert PHMB ähnlich wie gegenüber den CHO-Zellen. Die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte betragen nach 30 min Kontakt mit den L929-Zellen 59 µg/ml (NR-Test) bzw. 127 µg/ml (MTT-Test) und nach 24 h Folgekultur 78 µg/ml (NR-Test) bzw. 93 µg/ml (MTT-Test). Gegenüber beiden Prüfzellen wird insbesondere im MTT-Test während der 24 h Nachkultur eine signifikante Zunahme in der Zytotoxizität nachgewiesen.</Pgraph> <Pgraph>Für den Wirkstoff OCT wird kein Revitalisierungs-Effekt gegenüber beiden Prüfzellen nachgewiesen. Im Gegenteil, sowohl im MTT- als auch NR-Test ist während der 24 h Folgekultur eine signifikante Zunahme der Zytotoxizität nachweisbar. Die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte betragen nach 30 min Kontakt mit den CHO-Zellen 22 µg/ml (NR-Test) bzw. 27 µg/ml (MTT-Test) und nach der 24 h Folgekultur 17 µg/ml (NR-Test) bzw. 18 µg/ml (MTT-Test). Für die L929-Zellen betragen die IC<Subscript>50</Subscript>-Werte nach 30 min Kontakt 35 µg/ml (NR-Test) bzw. 42 µg/ml (MTT-Test) und nach der 24 h Folgekultur 31 µg/ml (NR-Test) bzw. 27 µg/ml (MTT-Test).</Pgraph> </TextBlock> <TextBlock linked="yes" name="Diskussion"> <MainHeadline>Diskussion</MainHeadline> <Pgraph>Aus Untersuchungen zur In-vitro-Zytotoxizität unter Anwendung der NR- und MTT-Methode als Nachweisreaktionen können Abschätzungen zu primären und nachfolgenden zytotoxischen Wirkungen erfolgen. Der NR-Test erfasst hauptsächlich zytotoxische Reaktionen, die mit einer Veränderung an der Zellmembran verbunden sind. Der MTT-Test erfasst dagegen Änderungen der Aktivität der mitochondrialen Succinatdehydrogenase, einem intrazellulären Enzym; somit werden zytotoxische Reaktionen detektiert, die vornehmlich intrazellulär stattfinden. Mit dem verwendeten Untersuchungsschema, der Bestimmung der Zytotoxizität nach 30 min Kontaktzeit der Prüfzellen mit dem antiseptischen Wirkstoff und einer nach der 30 min Kontaktzeit folgenden 24 h Kultur der Prüfzellen mit Entfernen der Wirkstoffe können teilweise zelluläre Wirk- bzw. Transportmechanismen für die jeweilige Substanz aufgedeckt werden. Dabei reagieren die Epithelzellen empfindlicher als die Fibroblasten. </Pgraph> <Pgraph>PVP-enthaltende Präparate besitzen eine identische IC<Subscript>50</Subscript> im MTT- und NR-Test. Demzufolge wirkt Iod sowohl gegenüber der Zellmembran als auch intrazellulär parallel und gleichzeitig zytotoxisch. Die geschädigten Fibroblasten und Epithelzellen mit >20% Vitalität nach 30 min Exposition revitalisieren vollständig innerhalb der 24 h Folgekultur, d.h. die nach 30 min nachgewiesenen zytotoxischen Veränderungen werden durch die Zellaktivität während der 24 h Folgekultur aufgehoben. </Pgraph> <Pgraph>Der Wirkstoff PHMB reagiert primär und nachfolgend unterschiedlich zytototoxisch gegenüber beiden Prüfzellen im MTT- und NR-Test. Die geschädigten Fibroblasten und Epithelzellen mit Erhalt der Vitalität >50% nach 30 min Exposition revitalisieren teilweise während der 24 h Folgekultur ohne Wirkstoffanwesenheit. Konzentrationen mit <50% Zellvitalität rufen während der 24 h Folgekultur eine höhere zytotoxische Reaktion im NR-Test hervor. Im MTT-Test wird die nach 30 min Kontakt mit den Prüfzellen nachgewiesene zytotoxische Reaktion von PHMB während der 24 h Folgekultur verstärkt. PHMB bindet primär an Phospholipide der Zellmembran <TextLink reference="3"></TextLink>, was durch den niedrigeren IC<Subscript>50</Subscript>-Wert im NR-Test gegenüber dem MTT-Test ausgedrückt wird. Das Zellmembran-ständige PHMB wird dann möglicherweise intrazellulär weiter transportiert zu den hochaffinen sauren Phospholipiden (Cardiolipin) der Mitochondrien, was sowohl durch die Zunahme der zytotoxischen Reaktion im MTT-Test als auch durch die teilweise Rivitalisierung bei PHMB-Konzentrationen <IC<Subscript>50</Subscript> im NR-Test nach der 24 h Folgekultur bekräftigt wird. </Pgraph> <Pgraph>Der Wirkstoff OCT wirkt gegenüber beiden Prüfzellen primär und nachfolgend gleich zytotoxisch im MTT- und NR-Test. Zell-gebundenes OCT wirkt in beiden Nachweisverfahren während der 24 h Folgekultur verstärkt zytotoxisch. Diese Reaktionsfolge wurde ebenfalls für die Wirkstoffe Chlorhexidindigluconat (CHX) und silberhaltige Verbindungen, wie z.B. AgNO<Subscript>3</Subscript>, Ag(I)-sulfadiazin und Silberprotein nachgewiesen (Ergebnisse nicht gezeigt). Im Unterschied zu diesen Wirkstoffen bleibt zellgebundenes OCT jedoch gegenüber Mikroorganismen weiterhin biologisch aktiv <TextLink reference="4"></TextLink>. </Pgraph> <Pgraph>Bei der Wertung der Ergebnisse ist zu berücksichtigen, dass in einer doppelblinden, randomisierten, stratifizierten, kontrollierten Studie in Parallelgruppen beim Schwein durch Lavasept<Superscript>®</Superscript> die Wundheilung signifikant im Vergleich zu Octenisept<Superscript>®</Superscript>. und Ringer-Lösung (Kontrolle) gefördert wurde, wobei sich der Einfluss auf die Wundheilung zwischen Octenisept<Superscript>®</Superscript> und Ringer-Lösung nicht unterschied <TextLink reference="5"></TextLink>. Dieser Unterschied könnte in der partiell revitalisierenden Wirkung von Polihexanid begründet sein. Im Unterschied dazu wird die Heilung exp. Wunden bei Nagetierspecies bereits durch 0,75% PVP-Iod und durch 0, 1% Chlorhexidin gehemmt <TextLink reference="6"></TextLink>. Diese PVP-Iod-Konzentration ist fast doppelt so hoch wie die für die Zellinien ermittelte IC<Subscript>50</Subscript>, so dass zumindest ohne Nachspülen in vivo offensichtlich keine Revitalisierung stattfindet. Allerdings bewirkte PVP-Iod an exp. Wunden des Meerschweinchens 2%ig noch eine Wundheilungsförderung um 25% und erst durch 5% wurde die Wundheilung im Vergleich zu Ringerlösung um 43% gehemmt. Insofern ist das beobachtete Phänomen der Revitalisierung auch im Bereich mikrobiozid wirksamer Konzentrationen als relevant anzusehen. Als Konsequenz könnte abgeleitet werden, dass durch Abspülen mit Ringerlösung innerhalb 30 min nach Anwendung von PVP-Iod die Wundverträglichkeit von PVP-Iod zu verbessern wäre. </Pgraph> <Pgraph>In die erhaltenen in vitro-Ergebnisse ordnen sich die tierexperimentellen Ergebnisse zur Wundheilungsförderung <TextLink reference="7"></TextLink> und Behandlungsergebnisse mittels Polihexanid behandelter Spalthautnetztransplantate ein. Diese waren durch rasch fortschreitende Reepithelisation gekennzeichnet, während nach Anwendung von PVP-Iod und Silbernitrat tief reichende Nekrosen und ausgeprägte Fibrinaustritte beobachtet wurden. In Übereinstimmung dazu epithelisierten mit Polihexanid behandelte Verbrennungswunden 2. Grades ohne weiteres Debridement und ohne klinische Infektionszeichen nach durchschnittlich 10 d bei auffälliger Schmerzfreiheit. Im Gegensatz zur Anwendung von Silbernitrat konnte kein Fibrinfilm auf der Wunde beobachtet werden. Als Schlussfolgerung wird aus dieser klinischen Anwendungsstudie abgeleitet, dass für Verbrennungswunden 2. Grades, die nicht primär plastisch-chirurgisch gedeckt werden können, der Wirkstoff Polihexanid zur Wundantiseptik geeignet ist, weil er trotz antiseptischer Wirksamkeit nicht die Reepithelisierung behindert <TextLink reference="8"></TextLink>. </Pgraph> </TextBlock> <TextBlock linked="yes" name="Fazit"> <MainHeadline>Fazit</MainHeadline> <Pgraph>Die zytotoxischen Reaktionen von PVP-I-haltigen Präparaten sind in einem definierten Konzentrationsbereich (>20% Zellvitalität) reversibel. </Pgraph> <Pgraph>Die zytotoxische Wirkung von PHMB ist nur für die Zellmembran-Zytotoxizität bei Konzentrationen unterhalb der IC<Subscript>50</Subscript>, d.h. Zellvitalität >50%, teilweise reversibel. Eine vollständige Revitalisierung ist jedoch nicht möglich, da gleichzeitig die intrazelluläre zytotoxische Wirkung von PHMB zunimmt. Bedingt wird die Zunahme der Zytotoxizität nach 24 h Folgekultur durch einen möglichen Transport von PHMB von der Zellmembran zu den Mitochondrien, wobei das anionische Phospholipid Cardiolipin eine entscheidende Rolle spielt.</Pgraph> <Pgraph>Die zytotoxische Wirkung von sowohl OCT als auch CHX und silberhaltigen Präparaten ist irreversibel. Der von den Zellen gebundene Wirkstoff bleibt gebunden und verstärkt während der 24 h Folgekultur seine zytotoxische Wirkung. Zellgebundenes OCT besitzt jedoch gegenüber zellgebundenem CHX den Vorteil, dass es biologisch auch gegenüber Mikrorganismen aktiv bleibt. Die losgelöste Betrachtung nur der zytotoxischen Wirkung eines antiseptischen Wirkstoffs kann demzufolge zu einer irreführenden Aussage führen. Eine Abschätzung der Eignung eines antiseptischen Wirkstoffs für die jeweilige klinische Fragestellung ist deshalb nur durch gleichzeitige Betrachtung von mikrobiozider und zytotoxischer Wirkung sinnvoll, wie es mit dem Biokompatibilitäsindex möglich ist <TextLink reference="9"></TextLink>.</Pgraph> </TextBlock> <References linked="yes"> <Reference refNo="1"> <RefAuthor>Mosmann T</RefAuthor> <RefTitle>Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays</RefTitle> <RefYear>1983</RefYear> <RefJournal>J Immunol Meth</RefJournal> <RefPage>55-63</RefPage> <RefTotal>Mosmann T. Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. 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