dgkh000017 Originalarbeit In-vitro bactericidal activity of maggots of the green blowfly (Lucilia sericata) Daeschlein Daeschlein Georg G

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

author Hoffmeister Hoffmeister Britta B

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

author Below Below Harald H

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

author Kramer Kramer Axel A Prof. Dr. med.

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Walther-Rathenau-Str. 49 a, 17489 GreifswaldInstitut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

kramer@uni-greifswald.de author German Medical Science

Düsseldorf, Köln

610 L. sericata Maden Bakterienelimination in vitro Eliminationsleistung >3 lg 20060830 germ not yet available 1 1 GMS Krankenhaushygiene Interdisziplinär GMS Krankenhaushyg Interdiszip Die infizierte Problemwunde 17 Maden werden vor allem zur Behandlung chronischer Wunden eingesetzt, weil dadurch vielfach chirurgische Interventionen und z. T. lang dauernde antiseptische Therapien überflüssig werden. Zur Quantifizierung der antibakteriellen Wirkung von Maden wurde in Anlehnung an den quantitativen Suspensionstest gemäß EN 1040 ein Testmodell entwickelt, bei dem eine Kokultur von Maden und Bakterien (M.luteus, MSSA, MRSA, E.coli) in CSL-Bouillon eingesetzt wurde. In Abimpfungen aus der Bouillon wurde nach 24, 48 bzw. 72 h Exposition die Koloniezahl im Vergleich ohne bzw. mit Madenexposition ermittelt. Der mittlere lg Reduktionsfaktor (RF) für die Bakterienelimination pro Made war zu allen untersuchten Zeitpunkten für alle Testbakterien >3,0. Damit werden die Wirkungsanforderungen an ein Antiseptikum bei Eiweißbelastung erfüllt. Ergänzend wurde die Eliminationsleistung innerhalb 24 h für überwiegend aus der unbelebten Umgebung stammende Wundinfektionserreger (E. faecium, P. aeruginosa, B. subtilis) geprüft und ebenfalls ein RF >3,0 ermittelt. Maggots of Lucilia sericata are used as an alternative to surgical intervention and long-term antiseptic therapy for the treatment of chronic wounds. To quantify the bactericidal effect of secretions from larvae, an in-vitro test model based on the modified European quantitative suspension test (EN 1040) was developed, in which a co-culture of maggots and bacteria (Micrococcus luteus, Escherichia coli, Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus) in tryptic soy broth was tested. The numbers of bacterial colonies with and without maggot exposure were compared after 24, 48, and 72 h of exposure. The mean log10 reduction factor (RF) for bacterial elimination per maggot was > 4 at all examined times for all tested bacteria. Thus, maggot secretion fulfilled the required definitions of an antiseptic. In addition, maggot's ability of ingesting bacteria was also evaluated. Maggots contained viable bacteria after 48 h of contact with the respective organisms. These maggots also continued excreting bacteria. Einleitung Erste systematische klinische Anwendungen von Fliegenmaden wurden von Baer bei chronischer Osteomyelitis 1931 publiziert . In den Folgejahren begann der Einzug der Madentherapie in die Wundchirurgie vor allem in England und den USA , . Durch die Erfolge der Antibiotikatherapie, der Wundantiseptik und der modernen Intensivtherapie verlor die Madentherapie zunächst an Bedeutung und rückte erst wieder vornehmlich im letzten Dezennium in den Blickpunkt des Interesses. Ein wesentlicher Aspekt dafür war die Möglichkeit des Verzichts auf chirurgisches Debridement speziell bei älteren Patienten mit chronischen Wunden und/oder Op-Risikofaktoren sowie die Behandlung bei mangelndem Erfolg anderweitiger Therapieformen . Hauptsächliche Indikationen für die Madentherapie sind chronische venöse und diabetische Ulcera und Dekubitalulcera, seltener dehiszente chirurgische Wunden, Verbrennungswunden sowie die MRSA-Sanierung , , , , , , . Zur Wundbehandlung werden Maden von L. sericata eingesetzt. Die Wirkung auf die Wundheilung beruht auf folgenden Mechanismen: Abgabe Antibiotika-ähnlicher Wirkstoffe , , , , , , Ingestion und Digestion von Bakterien und nekrotischem Material , sowie der Stimulation der Fibroblastenproliferation u. a. über Freisetzung des Hormons 20-Hydroxyecdysone . Während zur Anwendung der Madentherapie ein umfangreiches Schrifttum vorliegt, wurde das quantitative Ausmaß der Erregerelimination durch Maden bisher nicht mit etablierten Prüfverfahren zur Prüfung von Antiseptika untersucht. In Anlehnung an den quantitativen Suspensionstest gemäß EN 1040 sollte dazu ein Testmodell in flüssiger Kokultur von Maden mit Bakterien entwickelt werden. Material und Methoden Fliegenmaden Als deklariertes Arzneimittel (PZN 0305219, Biomonde GmbH Barsbüttel, Germany) wurden industriell hergestellte sterile Maden der Species Lucilia (L.) sericata im 2. Larvenstadium (ca. 3 mm Länge) eingesetzt. Testung in flüssigem Kulturmedien Lebende Maden wurden in Über-Nacht- Bakterienkultur in CSL in schräg gestellte Petrischalen eingebracht (Abbildung 1 ) und für 24, 48 und 72 h (bzw. bei einer Species für 96 und 120 h) bei 34°C exponiert (Abbildung 2 ). Durch die Schrägstellung mit 30° Neigungswinkel wird ein längeres Überleben der Maden im Flüssigmedium im Vergleich zur waagerechten Position ermöglicht. Zur Ermittlung der Anzahl überlebender Testbakterien wurden 100 µL aus jedem Testansatz auf Trypticase Soya Agar (Oxoid, Wedel, Germany) ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C 24 h bebrütet und anschließend die koloniebildenden Einheiten (KbE) ausgezählt. Die Reduktion der KbE (sog. Reduktionsfaktor) durch die Maden wurde aus der Differenz lg KbE Kontrollansatz - lg KbE Testansatz für jede Expositionszeit pro Made berechnet. Als Bakterienspecies wurden Micrococcus luteus (ATCC 9341) als häufiger Besiedler vor allem chronischer Wunden und Staphylococcus aureus als Methicillin-sensitiver Stamm (MSSA, ATCC 6538) und als methicillinresistenter Stamm (MRSA, Patientenisolat von chronischer Wundinfektion) sowie E. coli (ATCC 11229) als weiterer typische Erreger von Wundinfektionen eingesetzt. In einer weiterführenden Untersuchung wurde die Eliminationsleistung gegenüber Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) und Enterococcus faecium (ATCC 6057) als vorwiegend aus der unbelebten Umgebung stammende Erreger und gegenüber Bacillus subtilis (ATCC 9372) als ubiquitärem Kontaminanten bei 24 h Exposition geprüft. Ergebnisse Eliminationsleistung in Flüssigmedium Bei M. luteus und den drei Repräsentanten für häufige Wundinfektionen konnte innerhalb 24 h Exposition mit den Maden in der Bakteriensuspension pro Made eine Reduktionsleistung >3 lg ermittelt werden (Tabelle 1 ). Die höchste Reduktionsleistung war gegenüber E. coli mit 8,7 lg nachweisbar. Abhängig von der Anzahl der durchgeführten Assays differierte die Streuung der Ergebnisse für die Reduktionsleistung z. T. erheblich (von 0,9 - 5,9 lg). Bei MRSA und E. coli ergab sich die maximale Eliminationsleistung bereits innerhalb von 24 h (Tabelle 1 ). Bei MRSA und M. luteus übertraf die Reduktionsleistung sowohl nach 48 als auch nach 72 h die Reduktionsleistung nach 24 h. In orientierenden weiterführenden Versuchen ergaben sich bei 24 h Inkubation folgende Eliminationsleistungen: E. faecium 3,1 ± 3,9, P. aeruginosa 5,8 ± 3,9 und B. subtilis 4,9 ± 4,2 lg. Diskussion Gegenüber den geprüften grampositiven und gramnegativen Bakterienpecies war im nach EN 1040 modifizierten quantitativen Suspensionstest in der Flüssigkultur ausnahmslos eine Reduktionsleistung >3 lg pro Made nachweisbar. Diese Eliminationsrate wurde auch auf festem Kulturmedium erreicht. Für Antiseptika wird gegenüber Bakterien eine Reduktionsleistung von >5 lg ohne Belastung und ≥ 3 lg mit Belastung durch Eiweiß und Blut gefordert . Da die Prüfung den Testbedingungen mit Belastung entspricht, besitzen Maden eine vergleichbare Eliminationsleistung wie Antiseptika mit dem Unterschied, dass zusätzlich nekrotisches Gewebe aufgenommen und verdaut wird. Dadurch wird den Infektionserregern zusätzlich Nährboden entzogen. Die Eliminationsleistung der Maden hielt über 72 h unvermindert an. Bei Exposition der Maden mit MSSA war auch bei Prüfung nach 96 und 120 h, was einer häufigen Anwendungsdauer auf chronischen Wunden entspricht, eine unverminderte Eliminationsleistung nachweisbar. Durch einen Therapieansatz ("Biobag" oder "Freiläufer") werden 100 bzw. 200 Maden pro Wunde aufgebracht. Die dadurch erreichte Bakterienelimination ergäbe bei Hochrechnung auf die Wundverhältnisse innerhalb von 3 d mindestens den Wert von 106. Da die Bakteriendichte auf infizierten chronischen Wunden etwa 105 bis 106/g beträgt, findet die klinische Wirksamkeit der Madentherapie ihre Erklärung in der hohen Eliminationsleistung der Maden. Zusätzlich ist zu berücksichtigen, dass selbst bei stark nässenden Wunden keine unseren Testbedingungen in der Flüssigkultur vergleichbare Verdünnung abgegebener antibiotischer Madensekrete vorliegt, d. h. in der Wunde dürfte die Reduktionsleistung durch die Addition von Ingestion und antibakterieller Sekretwirkung noch höher als in vitro sein. Die Eliminationsleistung richtete sich ohne Unterschied gegen alle geprüften Bakterienspecies. Das deckt sich mit in vitro Befunden zur antibiotischen Wirkung von Madenextrakten gegen E. coli, M. luteus, P. aeruginosa, Salmonella spp, MSSA, MRSA, S. epidermidis und Listeria spp. . Pavillard und Wright berichten über eine sezernierte Substanz mit antibiotischer Wirksamkeit gegenüber Pneumokokken, Streptokokken der Gruppen A und B sowie S. aureus, aber fehlender Wirkung gegenüber C. albicans, B. subtilis. E. coli, S. typhimurium und P. vulgaris. Durch Abspülen gewonnene Madensekrete hatten eine hohe Hemmwirkung gegen S. aureus, Streptopkokken der Serogruppen A und B, waren aber nur schwach wirksam gegen MRSA und P. aeruginosa und unwirksam gegen E. coli, P. mirabilis und Enterococcus spp. . Da die Maden in der von uns gewählten Versuchsanordnung auch gegen E. coli und P. aeruginosa wirksam waren, kann die Madenwirkung nicht allein auf den von Pavillard und Wright sowie von Thomas et al. isolierten Substanzen beruhen. Unsere Versuche konnten zeigen, dass die alimentäre Aufnahme auch unabhängig von sezernierten Wirkstoffen ausreichend effektiv zu sein scheint, den Maden demnach mindestens 2 Wirkungsmechanismen der antibakteriellen Wirkung zur Verfügung stehen. Im Wundmilieu dürfte selbst bei stark nässenden Wunden keine unseren Testbedingungen vergleichbare Verdünnung der Madensekrete vorliegen, was die Bedeutung der alimentären Aufnahme bei der Bakterienreduktion unterstreicht. Selbstverständlich sind unsere in-vitro Testansätze nicht repräsentativ für ein natürliches Wundmilieu; sie sind jedoch zur quantitativen Erfassung der Eliminationsleistung geeignet. Wir nehmen an, dass zusätzlich zu den bisher nachgewiesenen antibakteriellen Wirkungsmechanismen auch eine peroxidasevermittelte Bakteriozidie mit Bildung von OSCN- im Verdauungstrakt und in den Sekreten der Maden zustande kommt, weil wir Thiocyanat (SCN- ) als Vorläufer von OSCN- und eine exogene Peroxidaseaktivität im Madenhomogenat in vitro nachweisen konnten. Darüber hinaus kommt es bei Kultivierung von Maden auf verschiedenen Nährböden zu einem 2 bis 10fachem Anstieg des SCN-- Gehalts im Nährmedium innerhalb von 24 bzw. 48 h. Anschließend sinken die SCN-- Gehalte wieder und fallen teilweise unter das Ausgangsniveau (in Vorb.). Der Nachweis von SCN- in den Maden und die Veränderung der SCN-- Werte in Nährmedien bei Madenkultur bestätigen nicht nur das ubiquitäre Vorkommen von SCN-, sondern seine spezielle Bedeutung als unspezifischer Resistenzmechanismus für Wirbellose. So enthalten Lumbriciden in allen Kompartimenten SCN- in einem Konzentrationsbereich von 0,13-1,3 mg/kg bzw. L. Abhängig vom alimentären Angebot sind vergleichbare Werte in den Ausscheidungen nachweisbar. Damit kommt es durch die Lebenstätigkeit des Regenwurms zu einem ständigen SCN- Eintrag in den Boden, was von Bedeutung für die Bodenfruchtbarkeit ist . Da in jedem Wundsekret eosinophile Peroxidase und Myeloperoxidase präsent ist , wird unabhängig von der Peroxidaseaktivität der Maden selbst durch deren SCN-- Exkretion die zusätzliche Bildung mikrobiozid hoch wirksamer Oxidationsprodukte von SCN- (bis O3SCN-) induziert. Angesichts der in unserer Studie nachgewiesenen hohen Reduktionsleistung >3 lg gegenüber wichtigen Wundinfektionserregern wird die historische Beschreibung der Madentherapie als "living antisepsis" nachvollziehbar und der antiseptische Einsatz von Maden in der Behandlung chronischer häufig schwierig zu therapierenden infizierter bzw. besiedelter Wunden ist eine geeignete Therapieoption, deren gezielter Einsatz noch weiter zu prüfen ist. Baer WS The treatment of chronic osteomyelitis with the maggot (larva of the blow fly) 1931 J Bone Jt Surg 438-75 Baer WS. The treatment of chronic osteomyelitis with the maggot (larva of the blow fly). J Bone Jt Surg. 1931;13:438-75. Bill TJ Ratliff CR Donovan AM Knox LK Morgan RF Rodeheaver GT Quantitative swab culture versus tissue biopsy: A comparison in chronic wounds 2001 Ost Wound Manag 34-7 Bill TJ, Ratliff CR, Donovan AM, Knox LK, Morgan RF, Rodeheaver GT. Quantitative swab culture versus tissue biopsy: A comparison in chronic wounds. 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Tabelle 1: Reduktionsfaktoren RF berechnet pro Einzelmade im Zeitverlauf von 24-72 h (Mittelwert des RF und Standardabweichung s) gegenüber M. luteus, MSSA, MRSA und E. coli

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1 1 Abbildung 1: Inkubation schräggestellter Petrischalen mit Kokulturen von Maden und Bakterien im 34°C Brutschrank

2 2 Abbildung 2: Maden in Kokultur mit MSSA

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