dgkh000079 Originalarbeit Interaction of octenidine and chlorhexidine with mammalian cells and the resulting microbicidal effect (remanence) of the combinations Müller Müller Gerald G

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

author Kramer Kramer Axel A Prof. Dr. med.

Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Walther-Rathenau-Straße 49 a, 17489 Greifswald, Deutschland, Tel.: +49-(0)3834-515542, Telefax: +49-(0)3834-515541Institut für Hygiene und Umweltmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald, Deutschland

kramer@uni-greifswald.de author German Medical Science

Düsseldorf, Köln

610 Remanenzwirkung Zellbindung Octenidindihydrochlorid Chlorhexidindigluconat 20071228 germ 1863-5245 2 2 GMS Krankenhaushygiene Interdisziplinär GMS Krankenhaushyg Interdiszip Die infizierte Problemwunde 2007 - The infected problem wound 2007 46 Die antiseptischen Wirkstoffe Chlorhexidindigluconat (CHX) und Octenidindihydrochlorid (OCT) werden von Mäusefibroblasten (L929, ATCC CCL1), menschlichen Epithelzellen (FL, ATCC CCL62) und primären menschlichen Keratinocyten gebunden. Der Wirkstoff ist durch Waschen der Zell-Wirkstoff-Kombination mit phosphat-gepuffertem Kochsalz (PBS) nicht zu entfernen. Die resultierenden Zell-Wirkstoff-Kombinationen besitzen eine remanente mikrobiozide Wirkung gegenüber den Prüfmikroorganismen Escherichia coli und Staphylococcus aureus. Diese Wirkung wird durch Anwesenheit von 10% fötalem bovinen Serum (FBS) nicht aufgehoben. Die mikrobiozide Wirkung von zellgebundenem OCT ist der von CHX weit überlegen, wenn vergleichbare Konzentrationen von Wirkstoff betrachtet werden. Möglicherweise wird CHX fester an oder in der Zellmembran verankert, wohingegen OCT insbesondere bei Anwesenheit von Mikroorganismen leichter von den Zell-Wirkstoff-Kombinationen freigesetzt wird. The antiseptic agents chlorhexidine digluconate (CHX) and octenidine dihydrochloride (OCT) are bound to murine fibroblasts (L929, ATCC CCL1), human epithelial cells (FL, ATCC CCL62), and primary human keratinocytes. The active agents cannot be removed by washing with phosphate buffered saline (PBS). The resulting combinations of cells and active agent are effective against the test microorganisms Escherichia coli and Staphylococcus aureus in a sustained release matter. The microbicidal activity has not inactivated by the presence of 10% fetal bovine serum (FBS). The microbicidal effect of cell-bound OCT is superior to cell-bound CHX comparing the same concentrations of active agent. Possibly, CHX is fixed more firmly at or in the cellular membrane, but not for OCT. In the presence of microorganisms OCT is released more easily from the combination cells and active agent than CHX. Einleitung Die Wirkstoffe Octenidindihydrochlorid (OCT) und Chlorhexidindigluconat (CHX) binden bevorzugt an saure Phospholipide der Plasmamembran von Mikroorganismen und der Zellmembran von humanen und Säugerzellen . Die Bindung ist mit einer toxischen Reaktion verbunden. Eine offene Frage ist jedoch, inwieweit der zellgebundene Wirkstoff gegenüber Mikroorganismen biologisch aktiv bleibt oder durch die Bindung an die Zelle inaktiviert wird. Methoden Für die durchgeführten Untersuchungen wurden Mäusefibroblasten der Linie L929 (ATCC CCL1), humane Epithelzellen der Linie FL (ATCC CCL62) und primäre menschliche epidermale Keratinocyten (NHEK.f, PromoCell) als Prüfzellen verwendet. Als antiseptische Wirkstoffe wurden OCT in Form von Octenisept® (Schülke & Mayr) und CHX in Form einer 20%-igen wässrigen Lösung (Sigma) ausgewählt. Die Herstellung der Wirkstoff-Zell-Kombinationen erfolgte nach dem Trypsinieren der adhärenten Zellkulturen. Nach dem Einstellen der Zelldichte auf 10x106 Zellen/ml in Zellkulturmedium ohne Zusatz von fötalem bovinen Serum (FBS) und ohne Antibiotika wurden gleiche Volumina Zellsuspension und Wirkstofflösung in Aqua ad iniectabilia kombiniert. Da OCT und CHX in der relativen Molmasse vergleichbar sind, wurde eine 0,1%-ige Wirkstoffkonzentration gewählt. Zusätzlich wurde auch eine 1%-ige CHX-Lösung eingesetzt. Nach 30 min Kontaktzeit der Bindungspartner erfolgte die Aufbereitung und Isolierung der Zell-Wirkstoff-Kombinationen durch mindestens 5mal Waschen mit sterilem phosphat-gepufferten Kochsalz (PBS). Nach der Waschprozedur wurde die Zelldichte und damit die theoretische Wirkstoffkonzentration durch Suspendieren in Zellkulturmedium mit 10% FBS auf 5x106 Zellen/ml mit 0,05% CHX bzw. OCT und 1x106 Zellen/ml mit 0,01% Wirkstoff eingestellt. Im Fall der Umsetzung der Zellen mit 1%-iger CHX-Lösung resultierten 5x106 Zellen/ml mit 0,5% CHX und 1x106 Zellen/ml mit 0,1% CHX. Die Mikrobiozidie-Testung erfolgte mittels quantitativen Suspensionstests nach DIN EN 1040 , wobei als bakterielle Inokuli Escherichia coli (ATCC 11229) als Vertreter der Gram-negativen Bakterien und Staphylococcus aureus (ATCC 6538) als Vertreter der Gram-positiven Bakterien eingesetzt wurden. Der quantitative Suspensionstest erfolgte unter Proteinbelastung, indem Zellkulturmedium mit 10% FBS (ca. 0,05% Serumalbumin) als Trägermittel diente. Das Zellkulturmedium sollte eine künstliche Wundflüssigkeit simulieren . Nach 30, 60 und 120 min erfolgte die Bestimmung der restlichen kolonienbildenden Einheiten im Vergleich zur Kontrolle im Zellkulturmedium. Ergebnisse Die resultierenden RF-Werte für die L929-, FL- und NHEK-Zellen gegenüber den Prüfmikroorganismen Escherichia coli und Staphylococcus aureus sind in Abbildung 1 , Abbildung 2 und Abbildung 3 zusammenfassend dargestellt. Die Abbildungen zeigen, dass die Wirkstoffe CHX und OCT von den Zellen gebunden werden, da trotz intensivem Waschen die Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit PBS nicht zu entfernen sind. Der von den Zellen gebundene Wirkstoff wirkt weiterhin mikrobiozid gegenüber den Prüfmikroorganismen Escherichia coli und Staphylococcus aureus, d.h. die Bindung an die Zellen neutralisiert die Wirkstoffe nicht. Die mikrobiozide Wirkung von OCT-Zell-Kombinationen ist der von CHX-Zell-Präparaten überlegen, wenn gleiche eingesetzte Wirkstoff-Ausgangskonzentrationen verglichen werden. Mehr als 3-log-Stufen Reduktion werden von allen Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit 0,05% OCT bereits nach 30 min gegenüber beiden Prüfmikroorganismen erzielt, wohingegen die Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit 0,5% CHX nur gegenüber Staphylococcus aureus nach 2 h eine Reduktion um 3-log-Stufen erreichen. Die Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit 0,01% OCT erzielen bereits nach 30 min Kontakt mit den Prüfmikroorganismen 2-4 log-Stufen Reduktion. Reduktionsfaktoren von 5–6 log-Stufen, wie sie bereits von 0,01% Verdünnungen von OCT erzielt wurden, konnten für CHX auch bei der höchsten Einsatzkonzentration von 0,1% nicht erreicht werden. Die Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit einer vergleichbaren Konzentration von 0,01% CHX sind in ihrer mikrobioziden Wirkung nach 30 min zu vernachlässigen. Diskussion Die antiseptischen Wirkstoffe CHX und OCT werden durch humane und Säugerzellen gebunden. Sie liefern somit eine Art Wirkstoffdepot, aus dem bei Bedarf der Wirkstoff freigesetzt werden kann. Diese Depot- oder Remanenzwirkung konnte durch die in dieser Studie nachgewiesene mikrobiozide Wirksamkeit der zellgebundenen Substanzen bestätigt werden. Die mikrobiozide Wirksamkeit von zellgebundenem OCT ist jedoch der von CHX bei vergleichbaren Konzentrationen weit überlegen. Zu ähnlichen Ergebnissen kommen andere Studien, die sich insbesondere mit der Anti-Plaque-Wirkung von CHX und OCT beschäftigten. OCT-haltige Präparate sind als Mundspüllösung und als Anti-Plaque-Mittel der Wirkung von CHX-haltigen Formulierungen weit überlegen , , , . Fazit Durch Bindung der Wirkstoffe CHX und OCT an Säugerzellen und humane Zellen wird die mikrobiozide Wirksamkeit nicht aufgehoben. Die mikrobiozide Wirksamkeit von zellgebundenem OCT ist der von CHX bei vergleichbaren Konzentrationen weit überlegen. Mehr als 3 log-Stufen Reduktion werden bereits nach 30 min Kontakt von 0,05% zellgebundenem OCT gegenüber beiden Prüfmikroorganismen erreicht. 0,01% zellgebundenes OCT erzielen nach 2 h Kontakt mit beiden Prüfmikroorganismen 5-6 log-Stufen Reduktion, was von 0,01% zellgebundenem CHX nicht zu erreichen ist. Die mikrobiozide Wirkung von 0,01% zellgebundenem CHX beträgt <1 log-Stufe und ist somit zu vernachlässigen. Gilbert P Moore LE Cationic antiseptics: diversity of action under a common epithet 2005 J Appl Microbiol 703-15 Gilbert P, Moore LE. Cationic antiseptics: diversity of action under a common epithet. J Appl Microbiol. 2005;99:703-15. DIN 2005 Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika - Quantitativer Suspensionsversuch zur Bestimmung der bakteriziden Wirkung (Basistest) chemischer Desinfektionsmittel und Antiseptika - Prüfverfahren und Anforderungen (Phase 1) DIN EN 1040. Chemische Desinfektionsmittel und Antiseptika - Quantitativer Suspensionsversuch zur Bestimmung der bakteriziden Wirkung (Basistest) chemischer Desinfektionsmittel und Antiseptika - Prüfverfahren und Anforderungen (Phase 1). Deutsche Fassung EN 1040:2005. Campbell KE Keast D Woodbury G Houghton P Wear time in two hydrocolloid dressings using a noval in-vivo model 2003 Wounds 40-8 Campbell KE, Keast D, Woodbury G, Houghton P. Wear time in two hydrocolloid dressings using a noval in-vivo model. Wounds. 2003;15(2):40-8. Emilson CG Bowen WH Robrish SA Kemp CW Effect of the antimicrobial agents octenidine and chlorhexidine on the plaque flora in primates 1981 Scand J Dent Res 384-92 Emilson CG, Bowen WH, Robrish SA, Kemp CW. Effect of the antimicrobial agents octenidine and chlorhexidine on the plaque flora in primates. Scand J Dent Res. 1981;89:384-92. Robrish SA Emilson CG Kemp CW Eberlein D Bowen WH A comparison of viable counts and adenine nucleotide analysis to determine the effect of antimicrobial agents on dental plaque 1981 Curr Microbiol 343-47 Robrish SA, Emilson CG, Kemp CW, Eberlein D, Bowen WH. A comparison of viable counts and adenine nucleotide analysis to determine the effect of antimicrobial agents on dental plaque. Curr Microbiol. 1981;5:343-47. Slee AM O´Connor JR In vitro antiplaque activity of octenidine dihydrochloride (WIN 41464-2) against preformed plaques of selected oral plaque-forming microorganisms 1983 Antimicrob Agents Chemother 379-84 Slee AM, O´Connor JR. In vitro antiplaque activity of octenidine dihydrochloride (WIN 41464-2) against preformed plaques of selected oral plaque-forming microorganisms. Antimicrob Agents Chemother. 1983;23:379-84. Kramer A Höppe H Krull B Pitten F-A Rosenau S Antiseptic efficacy and acceptance of Octenisept® compared to common antiseptic mouthwash solutions 1998 Int J Hyg Environm Med 443-56 Kramer A, Höppe H, Krull B, Pitten F-A, Rosenau S. Antiseptic efficacy and acceptance of Octenisept® compared to common antiseptic mouthwash solutions. Int J Hyg Environm Med. 1998; 200:443-56. 0

1 1 Abbildung 1: Reduktionsfaktoren RF (log 10 ) für die verschiedenen L929-Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit Chlorhexidindigluconat (CHX) und Octenidindihydrochlorid (OCT) nach 30, 60 und 120 min Kontaktzeit mit den Prüfmikroorganismen Escherichia coli (links) und Staphylococcus aureus (rechts) im quantitativen Suspensionsversuch bei Anwesenheit von 10% fötalem bovinen Serum (FBS)

2 2 Abbildung 2: Reduktionsfaktoren RF (log 10 ) für die verschiedenen FL-Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit Chlorhexidindigluconat (CHX) und Octenidindihydrochlorid (OCT) nach 30, 60 und 120 min Kontaktzeit mit den Prüfmikroorganismen Escherichia coli (links) und Staphylococcus aureus (rechts) im quantitativen Suspensionsversuch bei Anwesenheit von 10% fötalem bovinen Serum (FBS)

3 3 Abbildung 3: Reduktionsfaktoren RF (log 10 ) für die verschiedenen NHEK-Zell-Wirkstoff-Kombinationen mit Chlorhexidindigluconat (CHX) und Octenidindihydrochlorid (OCT) nach 30, 60 und 120 min Kontaktzeit mit den Prüfmikroorganismen Escherichia coli (links) und Staphylococcus aureus (rechts) im quantitativen Suspensionsversuch bei Anwesenheit von 10% fötalem bovinen Serum (FBS)

3 0 0